三丁酸甘油酯平板透明圈法篩選脂肪酶高產菌株，根據菌株的形態特征、生理生化特性及分子生物學特征鑒定高產菌株，再用酸堿滴定法定量測定脂肪酶活性，該菌株硝酸鹽還原為陽性，可以水解淀粉和液化明膠。 基于16SrDNA的系統發育分析結果表明，SLB-1菌株與登記號NR116240的甲基營養型芽孢桿菌處于最小分支，因此SLB-1菌株與甲基營養型芽孢桿菌相同本研究分離鑒定脂肪酶產生菌Bacillus  methylotrophicus  SLB-1，該菌產生的脂肪酶為中性常溫酶.脂肪酶產生菌株的篩選、鑒定。 采集富含油的水樣，用羅丹明 B培養基進行初篩，形態觀察、生理生化試驗和16S  r  DNA序列分析相結合進行菌種鑒定，構建了系譜樹。 結果篩選了一株產生脂肪酶的細菌U5，鑒定為枯草[0x4e  22 ]。

通過單因素試驗和響應面試驗設計對發酵培養基中的三丁酸甘油酯、葡萄糖、尿素添加量進行發酵優化。 結果表明，最佳發酵培養基組分為： 三丁酸甘油酯2.0%(V/V  )、葡萄糖9 g/L、尿素8 g/L。 在該優化條件下，粗脂肪酶酶活性為4.3 U/m  L，比優化前的酶活性提高了16.22%。 綜合考慮密碼子嗜好性、RNA穩定性及自由能等因素，優化疏松棉狀嗜熱絲孢霉(tll  )耐熱脂肪酶(tll  )基因序列，合成全部基因。

將合成的tll基因連接到克隆載體上，將亞克隆連接到表達載體pHGWPT-tll上，通過根癌農桿菌對被孢霉sh2進行了轉化。 經過三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE及Western  Blotting鑒定，tll基因表達成功。 發酵72h，轉化子脂肪酶的活性最大為36U/mL。

轉化體通過等離子體變異得到的變異株脂肪酶的活性比出發株提高了約37%。 本研究將人工合成的RML基因RML克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9K，構建pPIC9K-rml誘導型表達載體。 表達載體被線性化轉化為巴斯德畢赤酵母GS115，用抗生素G418篩選，用三丁酸甘油酯mm板及PCR法篩選陽性重組工程菌。 工程菌發酵液經SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鑒定，脂肪酶RML在畢赤酵母中有效表達，顯示蛋白分子大小如預期。 進一步優化了包括培養基組分、誘導劑濃度、發酵溫度等優化在內的發酵條件。

優化的培養基組為： 甘油 4.0%，(NH4)2SO45.000 g/L，CaSO40.465 g/L，K2SO49.100 g/L。 培養條件采用：pH值6.0，生育階段溫度30，誘導階段采用22低溫誘導，誘導期每24 h補充甲醇濃度3%。 優化后，發酵液中RML的活力最高為116 U/ml，比優化前提高3.14倍。

http://m.panjingsheng686.cn/new_detail/id/17.html